अमेरिकन जर्नल ऑफ ड्रग डिलीवरी एंड थेरेप्यूटिक्स खुला एक्सेस

अमूर्त

एपोप्लास्ट तम्बाकू में ईरानी हेलिकोबैक्टर पाइलोरी से यूरिएज बी की अभिव्यक्ति

तबरीज़ी मालेकी

1. पृष्ठभूमि

हेलिकोबैक्टर पाइलोरी एक ग्राम-नेगेटिव जीवाणु है, जिसे सबसे पहले मार्शल और वॉरेन ने गैस्ट्राइटिस और पेप्टिक अल्सर वाले रोगियों के गैस्ट्रिक म्यूकोसा से अलग किया था। हेलिकोबैक्टर पाइलोरी गैस्ट्रिक म्यूकोसा में क्रोनिक संक्रमण का मुख्य कारण है, जो दुनिया की 50% आबादी को प्रभावित करता है। हाल ही में, एच. पाइलोरी को गैस्ट्रिक अल्सर, डुओडेनल सूजन और गैस्ट्राइटिस जैसी अन्य जटिलताओं का कारण भी पाया गया है। साहित्य के अनुसार, एच. पाइलोरी से संक्रमित रोगियों का एक बड़ा हिस्सा गैस्ट्रोडुओडेनल रोग विकसित नहीं कर सकता है और लंबे समय तक बिना लक्षण के रह सकता है। दूसरी ओर, दीर्घकालिक संक्रमण एडेनोकार्सिनोमा और गैस्ट्रिक लिंफोमा जैसी स्थितियों के जोखिम को बढ़ाता है।

कई अध्ययनों ने एच. पाइलोरी को एक अंतिम कार्सिनोजेनिक एजेंट के रूप में पुष्टि की है। हेलिकोबैक्टर पाइलोरी संक्रमण से जुड़ी मृत्यु दर, 34 संक्रमित पुरुषों में 1 मामला और 60 संक्रमित महिलाओं में 1 मामला अनुमानित की गई है। हेलिकोबैक्टर पाइलोरी बड़ी मात्रा में यूरियाज़ (पूरे प्रोटीन वजन का 10% - 15%) का उत्पादन करता है जो एच. पाइलोरी के अस्तित्व और रोगजनन के लिए आवश्यक है। कई एंजाइम यूरिया से अमोनिया और कार्बोनेट का उत्पादन करके एच. पाइलोरी के तत्काल वातावरण की अम्लता को कम करते हैं। हेलिकोबैक्टर पाइलोरी यूरियाज़ 550 kDa के आणविक भार वाला एक मल्टीमेरिक एंजाइम है, जिसे यूरिया (29.5 kDa) और यूरेबी (66 kDa) की दो अलग-अलग उप-इकाइयों से एकत्र किया जाता है। हाल ही में, शोधकर्ता एच. पाइलोरी संक्रमण के खिलाफ़ टीकों के विकास से चिंतित हैं। विभिन्न संभावित प्रतिजनों में से, यूरेबी को सबसे प्रभावी माना जाता है, क्योंकि शुद्ध यूरेबी के साथ चूहों के टीकाकरण से यूरिया के विपरीत, उच्च प्रतिरक्षाजनन और सुरक्षा प्राप्त होती है। टीकाकरण लक्ष्य के रूप में यूरिया का चयन इस तथ्य पर आधारित है कि झिल्ली प्रोटीन अक्सर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं।

इस अध्ययन में, हमने एपिटोप मैपिंग के लिए उच्च प्रदर्शन वाले एक पूर्वानुमान सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग किया। एक दूसरे के बगल में स्थित बी लिम्फोसाइट्स के कई विशिष्ट एपिटोप के साथ, इस प्रोग्राम ने यूरेबी जीन के एमिनो एसिड टुकड़े का चयन किया। इसके अलावा, एंटीजेनिक टुकड़े को एस्चेरिचिया कोली BL21(DE3) स्ट्रेन के एक पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में व्यक्त और शुद्ध किया गया था। इस अध्ययन का उद्देश्य प्रासंगिक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके महत्वपूर्ण एंटीजेनिक गुणों के साथ पुनः संयोजक यूरेबी (आरयूरेबी) का एक टुकड़ा प्रस्तुत करना था।

2. उद्देश्य

इस अध्ययन का उद्देश्य एच. पाइलोरी से यूरेबी के एंटीजेनिक क्षेत्र से युक्त एक पुनः संयोजक वेक्टर प्रदान करना था, जिसमें ई. कोलाई में कुल अनुक्रम और अभिव्यक्ति के बजाय एंटीजन के इम्यूनोडोमिनेंट एपिटोप्स का उपयोग किया गया था। साथ ही, हमारा उद्देश्य वैक्सीन उम्मीदवार के रूप में इसकी एंटीजेनिकता का निर्धारण करना और मनुष्यों में एच. पाइलोरी संक्रमण के सीरोलॉजिकल निदान में इसकी प्रभावकारिता का आकलन करना था।

3. विधियाँ

3.1. बैक्टीरिया, प्लास्मिड और अन्य अभिकर्मकों की तैयारी

इस अध्ययन में, नियमित निदान एंडोस्कोपी से गुजरने वाले अपच रोगियों की बायोप्सी से एच. पाइलोरी को संवर्धित किया गया था। बायोप्सी से पहले, अध्ययन में भाग लेने के लिए सभी रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। पिछली रिपोर्टों के निष्कर्षों के आधार पर संस्कृति की स्थिति निर्धारित की गई थी। अलग-अलग बायोप्सी नमूनों को ब्रुसेला अगर (मर्क, जर्मनी) पर संवर्धित किया गया था, जिसमें ट्राइमेथोप्रिम (5 µg/mL), वैनकॉमाइसिन (10 µg/mL) और एम्फोटेरिसिन बी (2.5 µg/mL) शामिल थे, जिसे 5% भेड़ के रक्त के साथ पूरक किया गया था।

37 डिग्री सेल्सियस (CO2: 10%) पर 3 - 5 दिनों के लिए माइक्रोएरोफिलिक स्थितियों के तहत ऊष्मायन के बाद, विकसित बैक्टीरिया की पहचान नियमित माइक्रोबायोलॉजिकल परीक्षणों के माध्यम से एच. पाइलोरी के रूप में की गई, जिसमें ग्राम धुंधलापन, साथ ही ऑक्सीडेज, यूरिएज और कैटेलेज परीक्षण शामिल थे। आगे के मूल्यांकन के लिए, हमने pET-32a और pBSK वैक्टर (नोवाजेन इंक., यूएसए) का उपयोग किया। इसके अलावा, pET-32a वेक्टर का उपयोग 6-हिस्टिडीन टैग और एन-टर्मिनल T7 एपिटोप टैग के साथ फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए किया गया था। इन अतिरिक्त अमीनो एसिड ने उत्पादित प्रोटीन के वजन को 20 kDa तक बढ़ा दिया। इस अध्ययन में, प्रतिबंध एंजाइम और डीएनए लाइगेज को फ़र्मेंटस (लिथुआनिया) से खरीदा गया था, और प्रारंभिक क्लोनिंग के लिए ई. कोली DH5α स्ट्रेन (स्ट्रैटेगेन, यूएसए) का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, पुनः संयोजक pET-32a (pET-32a UreB) को बैक्टीरिया के मेजबान स्ट्रेन के रूप में E. कोली BL21(DE3)pLysS (नोवाजेन, यूएसए) में बदल दिया गया। नियमित बैक्टीरियल कल्चर के लिए, हमने लाइसोजेनी शोरबा (लूरिया-बर्टानी शोरबा, एलबी; सिग्मा, यूएसए) का इस्तेमाल किया। एम्पीसिलीन (100 µg/mL) और क्लोरैम्फेनिकॉल (34 µg/mL; सिग्मा, यूएसए) सहित आवश्यक एंटीबायोटिक्स को एलबी माध्यम (10) में मिलाया गया। रसायन मर्क (जर्मनी) से खरीदे गए थे, और एंजाइम फर्मेंटस (लिथुआनिया) और सिनाक्लोन कंपनी से प्राप्त किए गए थे।

परिणाम: पीसीआर के अनुक्रमण परिणाम पुनः संयोजक प्लास्मिड में यूरेबी जीन क्लोनिंग के संकेत थे। प्रोटीन का उत्पादन आइसोप्रोपाइल β-डी थियोगैलेक्टोपाइरानोसाइड (आईपीटीजी) द्वारा प्रेरित किया गया था, और व्यक्त प्रोटीन को नी-एनटीए किट का उपयोग करके डायलिसिस के माध्यम से शुद्ध किया गया था। इसके अलावा, वेस्टर्न ब्लॉटिंग में एंटीबॉडी द्वारा 42 केडीए के आणविक भार वाले पुनः संयोजक प्रोटीन को पहचाना गया।

निष्कर्ष: एंटीबॉडी का मूल्यांकन इम्यूनोजेनिक अंश के लिए उच्च एंटीजेनिक गुणों का संकेत था, जिसकी भविष्यवाणी इम्यूनोलॉजिकल बायोइनफॉरमैटिक्स द्वारा की गई थी। इसलिए, यूरेबी रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन एच. पाइलोरी और अन्य डायग्नोस्टिक किट के खिलाफ टीकों के विकास के लिए एक उचित एंटीजन हो सकता है।